CÁC NGUYÊN LÝ VÀ PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM HIV
1. Đại cương:
1.1. Cấu trúc của virus HIV.
CẤU TRÚC CỦA VIRUS HIV
HIV có đặc điểm chung của họ retroviridae. Hạt virus hoàn chỉnh (virion) có cấu trúc gồm 3lớp.
1.1.1. Lớp vỏ ngoài (vỏ peplon): lớp này là 1 màng lipid kép có kháng nguyên chéo với màng nguyên sinh chất tế bào. Gắn lên màng này là các nhú. Đó là các phân tử Glycoprotein có trọng lượng phân tử 160 kilodalton (gp160). Nó gồm có 2 phần:
+ Glycoprotein màng ngoài có trọng lượng phân töû là 120 kilodalton (gp120). GP120 là kháng nguyên đã biến đổi nhất, gây khó khăn cho phản ứng bảo vệ cơ thể và chế vaccin phòng bệnh.
+ Glycoprotein: xuyên màng có trọng lượng phân töû 41 kilodalton.
1.1.2. Vỏ trong (vỏ capsid): vỏ này gồm 2 lớp protein:
+ Lớp ngoài hình cầu, cấu tạo bởi protein có trọng lượng phân töû 18 kilodalton (p18).
+ Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi các phân tử có trọng lượng phân tử là 24 kilodalton (p24). Đây là kháng nguyên rất quang trọng để chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS.
1.1.3. Lõi:
Là những thành phần bên trong của vỏ capsid, bao gồm:
+ Hai phân tử ARN đơn, đó là bộ gen di truyền HIV(genom).
Genom của HIV chứa 3 gen cấu trúc: Gag (group specific antigen) là cac gen mã hoá cho các kháng nguyên đặc hiệu của capsid cuûa virus; Pol (polymerase) mã hoá cho các Enzym: reverve transcriptase (RT:Enzym sao mã ngược), protease và endonuclease (còn gọi kháng nguyên integrase); và EnV (envelop) mã hoá cho glycoprotein lớp vỏ peplon của HIV.
1.2. Sự xâm nhập vào tế bào và nhân lên của virus HIV.
1.2.1. Sự hấp phụ lên bề mặt tế bào.
HIV bám vào bề mặt tế bào cảm thụ nhờ sự phù hợp giữa Receptor tế bào với GP120 của nó. Trong đa số các trường hợp, các receptor này là các phân tử CD4 của lympho T hỗ trợ hoặc một soá tế bào khác như bạch cầu đơn nhân lớn, đại thực bào và 1 số tế bào doøng lympho.
1.2.2. Sự xâm nhập vào tế bào:
Sau khi đã bám vào các receptor của tế bào vật chủ , phân tử gp41 của HIV cắm sâu vào màng tế bào. Nhờ đó genom của HIV chui vào bên trong của tế bào. Vì vậy giai đoạn này còn gọi là ‘cắm neo và hoà màng’.
1.2.3. Sự nhân lên trong tế bào:
1.2.3.1. Sao mã sớm: nhờ RT, ADN bổ sung của HIV đã được tạo thành (đã được tạo thành) từ khuôn mẫu ARN của nó. Lúc đầu là sản phẩm lai ARN_ADN, sau đó nhờ Enzym ARN_ase tách ARN khỏi ADN và sợi ADN bổ sung mới được tổng hợp, tạo thành phân tử ADN chuỗi kép.
1.2.3.2. Tích hợp.
Sau khi tổng hợp ADN kép tạo thành dạng vòng khép kín và chui vào nhân tế bào chủ. Sau đó nó tích hợp vào ADN nhờ integrase .
Nhờ tích hợp, HIV đã tránh được sự bảo vệ cơ thể, tác dụng của thuốc và gây bệnh chậm.
Sau khi tích hợp, AND của HIV có toàn tại ở một trong 2 trạng thái:
- Không hoạt động và nằm im như tiền virus. Trạng thái tiềm tàng này có thể trở thành hoạt động như những virus độc lực dưới các tác động của môi trường.
- ADN bổ sung của HIV được sao chép thành hạt virion mới. Ñây là trạng thái nhân lên của HIV với các bước tiếp theo như sau:
1.2.3.3. Sao mã muộn:
ADN boå sung của HIV được sao mã thành ARN genom và ARN thoâng tin cho nó (mARN)
1.2.3.4. Dịch mã:
Nhờ mARN được tạo thành ở giai đoạn trên, các prrotein cần của HIV được toång hợp.
1.2.3.5. Lắp ráp các hạt virion mới:
Từ các thành phần đã được toång hợp, các hạt HIV mới được lắp ráp ở bào tương tế bào.
1.2.3.6. Giải phóng các hạt HIV mới:
Từ các vị trí lắp ráp các hạt HIV gần màng nguyên sinh chất, các màng này nảy chồi và các hạt HIV được giải phóng. Chúng tiếp tục gây nhiễm cho tế bào mới, còn tế bào đã giúp chúng nhân lên thì bị diệt.
2. Mịc tiêu xét nghiệm HIV.
2.1. Giám sát HIV/AIDS.
2.2. An toàn truyền máu.
2.3. Chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS.
2.4. Nghiên cứu khoa học.
3. Các phương cách xét nghiệm HIV.
3.1. Phương cách 1 . (áp dụng cho công tác an toàn truyền máu):
Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách I khi mẫu đó dương tính với một trong các thử nghiệm như: ELISA, Serodia hay thử nghiệm nhanh.
Trong truyền máu, mẫu máu được xét nghiệm với phương cách I nếu dương tính hay nghi ngờ đều phải loại bỏ.
3.2. Phương cách II: (áp dụng cho giám sát trọng điểm):
Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách II khi mẫu đó dương tính cả hai lần xét nghiệm bằng hai loại sinh phẩm với nguyên lý và chuẩn bị KN khác nhau.
3.3. Phương cách III: (chẩn đoán nhiễm HIV).
Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách III khi mẫu đó dương tính cả ba lần xét nghiệm bằng ba loại sinh phẩm với nguyên lý và chuẩn bị KN khác nhau.
4. Các nguyên lý và phương pháp xét nghiệm HIV.
4.1. Phương pháp gián tiếp:
Phát hiện kháng thể kháng HIV trong máu, dịch tiết.
Áp dụng:
- Giám sát dịch tễ.
- Chẩn đoán nhiễm HIV trên 18 tháng tuổi.
Các kỹ thuật tìm kháng thể được chia thành 2 loại:
* Các xét nghiệm phát hiện sàng lọc: cần có độ nhạy cao.
* Các xét nghiệm khẳng định: cần độ đặc hiệu cao.
4.1.1. Xét nghiệm phát hiện sàng lọc.
Các kỹ thuật: ELISA, các thử nghiệm nhanh có độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau. Phối hợp các kỹ thuật khác nhau trong các phương cách xét nghiệm phải tuân theo nguyên tắc:
* Thử nghiệm đầu tiên có độ nhạy cao.
* Các thử nghiệm tiếp theo có nguyên lý hoặc cách chuẩn bị KN khác nhau và cần có độ đặc hiệu cao.
4.1.1.1. Thử nghiệm miễn dịch gắn men – Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
* Nguyên lý chung:
- Kháng nguyên (Ag) virus cố định trên phiến nhựa.
- Kháng thể (Ab) kháng HIV của bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với Ag.
- Phức hợp Ag-Ab được phát hiện bởi hệ thống cộng hợp gắn enzyme và cho phản ứng hiện màu với cơ chất tương ứng.
4.1.1.1.1. ELISA gin tiếp: Độ nhạy cao huyết thanh cần thử ủ với bản nhựa đã gắn kháng nguyên, sau khi rửa để loại kháng thể thừa, không đặc hiệu, lại tiếp tục ủ với kháng thể kháng globulinngười gắn Enzym. Hoạt tính Enzym sẽ biến cơ chất không màu thành một sản phẩm có màu. Phản ứng màu được nhận định sơ bộ bằng mắt thường và đọc chính xác bằng quang kế.
Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể
4.1.1.1.2. ELISA sandwich: độ đặc hiệu và độ nhạy cao.
Cũng tương tự kỷ thuật ELISA gián tiếp chỉ khác là kháng nguyên virus có gắn Enzym được thay kháng thể globlin người gắn enzym. Như vậy hình thành 1 Sandwich của phức hợp KN_KT_KN_Enzym. Sự thay đổi này làm tăng độ nhạy và đô đặc hiệu của phản ứng, nó cũng cho cho phép phát hiện tất cả các lớp kháng thể vì không dùng Anti IgG người gắn Enzym.
4.1.1.1.3. ELISA cạnh tranh: Độ nhạy cao.
Nguyên lý phản ứng tương tự như hai loại trên song chỉ khác là huyết thanh của mẫu thử có KT kháng HIV ủ cùng với kháng thể kháng HIV có gắn Enzym. Như vậy có sự tranh chấp giữa hai loại kháng thể trong phản ứng kết hợp với KN-KT đã gắn vào pha rắn, Đậm độ KT trong mẫu thử càng cao thì KT càng ít được cố định vào KN . Cơ chất sẽ cho 1 phản ứng màu tỉ lệ nghịch với đâm đô KT của màu phải thử.
ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH GẮN MEN – ELISA.
* Ưu điểm:
- Thực hiện đồng thời được nhiều mẫu.
- Đọc kết quả bằng máy không phụ thuộc vào chủ quan của con người.
- Có thể lưu kết quả, thuận lợi cho kiểm tra đánh giá chất lượng xét nghiệm.
- Giá thành tương đối rẻ.
* Hạn chế:
- Phải đầu tư trang thiết bị ban đầu và bảo dưỡng máy.
- Sinh phẩm phải bảo quản lạnh.
- Nhân viên xét nghiệm phải được đào tạo.
- Thời gian thực hiện: 3 – 4 giờ.
- Nếu số lượng mẫu ít thì tốn kém vì phải làm nhiều chứng.
4.1.1.2. Các thử nghiệm nhanh.
4.1.1.2.1. Thử nghiệm ngưng kết hạt Serodia:
- Nguyên lý:
Những hạt gelatin được gắn với các thành phần KN của virus HIV sẽ tạo ngưng kết khi trong huyết thanh (hoặc huyết tương) bệnh nhân có KT kháng HIV.
- Kháng nguyên được gắn trên hạt gelatin:
HIV 1 gp41 protein tái tổ hợp.
HIV 1 p24 protein tái tổ hợp.
HIV2 gp36 protein tái tổ hợp.
4.1.1.2.2. Các thử nghiệm nhanh:
- Kit Determine HIV1/2: dựa trên nguyên lý miễn dịch sắc ký. (Thường sử dụng để kiểm tra HIV gấp và luôn phải được kiểm chứng bằng kỹ thuật khác)
- Kit Multispot HIV1/2: là phương pháp miễn dịch trên màng lọc, dựa trên nguyên lý ELISA (Phân biệt được HIV1 và HIV2).
* Ưu điểm:
- Xét nghiệm với số lượng mẫu nhỏ.
- Dễ thực hiện, cho kết quả nhanh.
- Không đòi hỏi thiết bị đặc biệt, sinh phẩm dễ bảo quản.
- Có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở.
- Xét nghiệm viên có thể được đào tạo nhanh.
* Nhược điểm:
- Giá thành cao.
- Không thuận lợi khi xét nghiệm số mẫu lớn.
- Không lưu được dữ liệu kỹ thuật.
- Một số test nhanh có độ nhạy kém hơn so với ELISA.
4.1.2. Xét nghiệm khẳng định.
Western blot (Kit New Lab blot I ):
4.1.2.1. Nguyên lý:
- Protein Virus HIV được tách theo PM bằng điện di trên gel polyacrylamid.
- Chuyển sang giấy nitrocellulose, các protein định vị theo PM.
- KT kháng HIV trong mẫu thử kết hợp đặc hiệu với KN tương ứng.
- Phát hiện phức hợp KN-KT bằng cộng hợp KT kháng IgG gắn men, cho phản ứng màu với cơ chất tại các vị trí có KT đặc hiệu với KN tương ứng. Western blot có độ nhạy và độ đặc hiệu cao; song giá thành cao và đòi hỏi người xét nghiệm phải có trình độ và kinh nghiệm.
4.1.2.2. Biện luận kết quả.
* WB âm tính: không có băng nào
* WB dương tính: có ít nhất 2 băng tương ứng với proteine vỏ:
HIV 1: gp 160, gp 120, gp 41
HIV 2: gp 140, gp 125, gp 36 ngoài ra có các băng tương ứng với sản phẩm của gen gag/pol.
* WB chưa xác định : có băng ở vị trí khác tiêu chuẩn WB dương tính.
4.2. Phương pháp trực tiếp:
Phát hiện trực tiếp: KN virus, axit nucleic hoặcVirus.
Áp dụng:
- Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh được sinh ra từ mẹ nhiễm HIV.
- Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV (giai đoạn cửa sổ) hoặc khi kết quả phát hiện KT không rõ ràng.
- Theo dõi diễn tiến bệnh, đánh giá hiệu quả điều trị thuốc kháng virút và trong các mục đích nghiên cứu khác.
4.2.1. Phân lập virus bằng nuôi cấy tế bào.
Nguyên lý:
- Tách tế bào đơn nhân trong máu bệnh nhân và nuôi cấy chung với tế bào đơn nhân của người lành đã được hoạt hóa trong môi trường nuôi cấy PHA (phytohemagglutinin) thích hợp.
- Xác định sự nhân lên của virus bằng kỹ thuật:
* ELISA phát hiện KN p24 trong nước nổi môi trường nuôi cấy tế bào.
* Dùng đồng vị phóng xạ phát hiện enzyme sao chép ngược của virus (RT).
4.2.2. Phát hiện các axit nucleic (RNA) của virus hoặc DNA (provirut) trong tế bào nhiễm.
* RNA của virus HIV bằng kỹ thuật RT-PCR:
· RNA enzyme sao chép ngược và mồi cDNA
· Quá trình PCR là chuỗi nhiều chu kỳ kế tiếp nhau.
Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
- Bước 1: biến tính tách rời 2 chuỗi của phân tử DNA đích ở nhiệt độ 940 – 950.
- Bước 2: bắt cặp, các cặp mồi đặc hiệu cho một trình tự DNA xác định bắt cặp với sợi DNA đích ở nhiệt độ 400 -700.
- Bước 3: tổng hợp, kéo dài. Ở nhiệt độ 720, Taq polymerase hoạt động tổng hợp sợi DNA có trình tự bổ sung cho sợi khuôn.
- Trong chẩn đoán nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh, ngoài RT- PCR còn dùng PCR phát hiện các DNA provirút trong tế bào nhiễm.
- PCR được thực hiện trên 3 vùng gen: env, gag và pol.
- Kết quả được trả lời dương tính khi có PCR dương tính ít nhất là trên hai trong ba gen và được thực hiện trên hai mẫu máu ở thời điểm khác nhau.
* Ưu điểm: có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh chóng.
* Hạn chế: phải có cơ sở phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn và trang thiết bị đắt tiền. Cán bộ cần đào tạo tốt.
4.2.3. Phát hiện KN p24 của virus trong máu
- p24 l một chỉ số trực tiếp phản ánh sự nhân lên của virut
- Được phát hiện sớm trong giai đoạn mới nhiễm.
- Giảm khi có KT kháng p24.
- Gia tăng khi chuyển sang giai đoạn AIDS
Kit phát hiện p24: ELISA sandwich.
* Nguyên lý:
KT đơn dòng kháng với KN p24 được gắn sẵn trong các giếng, nếu mẫu thử có KN p24 sẽ gắn với KT này và được phát hiện bằng cộng hợp (KT đa dòng kháng HIV) gắn men cho phản ứng màu với cơ chất.
4.3. Lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm HIV.
4.3.1. Sự biến động của các thông số sinh học trên bệnh nhân nhiễm HIV chưa điều trị.
- Kháng nguyên HIV đặc hiệu KNp24 xuất hiện sớm, một thời gian ngắn sau nhiễm HIV và duy trì trong suốt thời gian cấp (sớm) của nhiễm HIV. Sau đó KNp24 giảm dần đồng thời có sự xuất hiện KTp24. Điều này báo hiệu giai đoạn không triệu chứng của nhiễm HIV.
- Vài tháng tới vài năm sau nhiễm trùng, KTp24 mất đi v KNp24 tái xuất hiện, báo giai đoạn triệu chứng của bệnh. Sự nhân lên của HIV tương ứng với sự có mặt của KNp24.
- Kháng thể HIV: Trước tiên kháng thể HIV lớp IgM xuất hiện, sau đó giảm dần và thay vào đó là KT lớp IgG. IgG khng p24 xuất hiện và giảm dần cùng với sự mất đi và xuất hiện lại KN HIV. Trong khi đó IgG kháng KN vỏ của HIV tồn tại lâu dài trong suốt thời gian bị nhiễm.
4.3.2. Lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm HIV
4.3.2.1. Nguyên tắc chung.
- Mục đích xét nghiệm.
- Thời điểm phơi nhiễm.
- Đối tượng xét nghiệm.
- Tỷ lệ nhiễm trong quần thể.
- Thời gian cần trả lời kết quả.
- Điều kiện cụ thể của phòng thí nghiệm.
- Tư vấn trước xét nghiệm.
4.3.2.2. Lựa chọn cụ thể
4.3.2.2.1. Giai đoạn ủ bệnh:" giai đoạn cửa sổ sinh học". Giai đoạn này từ khi nhiễm HIV 1 tuần lễ: một số kỹ thuật có thể giúp ích chẩn đoán như:
- Phân lập virus.
- PCR.
- Phát hiện kháng nguyên p24.
- Phát hiện kháng thể Ig (kỹ thuật ELISA sandwich)
4.3.2.2.2. Giai đoạn có kháng thể
Kỹ thuật:
- Serodia.
- ELISA.
- Test nhanh.
- Western blot.
4.3.3. Nhận định kết quả.
4.3.3.1. Các phương pháp trực tiếp:
- Dương tính: kết luận dương tính.
- Âm tính: kết luận âm tính.
4.3.3.2. Các phương pháp xét nghiệm gián tiếp:
- Mẫu thử nghiệm âm tính lần đầu: kết luận âm tính.
- Để khẳng định mẫu HIV dương tính: Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với khi mẫu đó dương tính cả ba lần xét nghiệm bằng ba loại sinh phẩm với nguyên lý và chuẩn bị KN khác nhau.
QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM TẠI PHÒNG HIV BỆNH VIỆN PHONG - DA LIỄU TRUNG ƯƠNG QUY HOÀ
5. Kết luận: Để kết luận tình trạng mẫu thử là dương tính khi:
5.1. Tính hợp lệ của thử nghiệm:
Theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất sinh phẩm.
5.2. Chỉ thực hiện tại các phòng thí nghiệm HIV được phép khẳng định HIV dương tính.
5.3. Theo đúng hướng dẫn sử dụng sinh phẩm và đúng phương cách xét nghiệm.
5.4. Nếu kết quả giữa các thử nghiệm không phù hợp, hẹn 3 tháng sau lấy mẫu xét nghiệm lại.
Tài liệu tham khảo
1. Phạm nhật An và cs (1995), Nhiễm HIV/AIDS y học cơ sở, lâm sàng và phòng chống, NXBY học, Hà nội, 26-51.
2. Trần chí Liêm và CS (11-2001), xét nghiệm chẩn đoán HIV, Hà nội, 4-28.
3. Trương xuân Liên, tài liệu tập huấn tại viên Pasteur TPHCM
